माइक्रोबियल मेटाप्रोटिओमिक्स: नमूना प्रसंस्करण, डेटा संग्रह से लेकर डेटा विश्लेषण तक

वू एनहुई, क़ियाओ लियांग*

रसायन विज्ञान विभाग, फ़ुडन विश्वविद्यालय, शंघाई 200433, चीन

सूक्ष्मजीवों का मानव रोगों और स्वास्थ्य से गहरा संबंध है। सूक्ष्मजीव समुदायों की संरचना और उनके कार्यों को कैसे समझा जाए यह एक प्रमुख मुद्दा है जिसका तत्काल अध्ययन करने की आवश्यकता है। हाल के वर्षों में, सूक्ष्मजीवों की संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए मेटाप्रोटोमिक्स एक महत्वपूर्ण तकनीकी साधन बन गया है। हालाँकि, माइक्रोबियल समुदाय के नमूनों की जटिलता और उच्च विविधता के कारण, नमूना प्रसंस्करण, मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण वर्तमान में मेटाप्रोटोमिक्स के सामने आने वाली तीन प्रमुख चुनौतियाँ बन गए हैं। मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषण में, विभिन्न प्रकार के नमूनों के पूर्व-उपचार को अनुकूलित करना और विभिन्न माइक्रोबियल पृथक्करण, संवर्धन, निष्कर्षण और लसीका योजनाओं को अपनाना अक्सर आवश्यक होता है। एकल प्रजाति के प्रोटिओम के समान, मेटाप्रोटिओमिक्स में मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण मोड में डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मोड और डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) मोड शामिल हैं। डीआईए डेटा अधिग्रहण मोड नमूने की पेप्टाइड जानकारी को पूरी तरह से एकत्र कर सकता है और इसमें विकास की काफी संभावनाएं हैं। हालाँकि, मेटाप्रोटिओम नमूनों की जटिलता के कारण, इसका डीआईए डेटा विश्लेषण एक बड़ी समस्या बन गया है जो मेटाप्रोटिओमिक्स के गहन कवरेज में बाधा डालता है। डेटा विश्लेषण के संदर्भ में, सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस का निर्माण है। डेटाबेस का आकार और पूर्णता न केवल पहचान की संख्या पर बहुत प्रभाव डालती है, बल्कि प्रजातियों और कार्यात्मक स्तरों पर विश्लेषण को भी प्रभावित करती है। वर्तमान में, मेटाप्रोटिओम डेटाबेस के निर्माण के लिए स्वर्ण मानक मेटाजेनोम पर आधारित एक प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस है। साथ ही, पुनरावृत्तीय खोज पर आधारित सार्वजनिक डेटाबेस फ़िल्टरिंग पद्धति का भी मजबूत व्यावहारिक मूल्य साबित हुआ है। विशिष्ट डेटा विश्लेषण रणनीतियों के परिप्रेक्ष्य से, पेप्टाइड-केंद्रित डीआईए डेटा विश्लेषण विधियों ने एक पूर्ण मुख्यधारा पर कब्जा कर लिया है। गहन शिक्षण और कृत्रिम बुद्धिमत्ता के विकास के साथ, यह मैक्रोप्रोटेमिक डेटा विश्लेषण की सटीकता, कवरेज और विश्लेषण गति को काफी बढ़ावा देगा। डाउनस्ट्रीम जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के संदर्भ में, हाल के वर्षों में एनोटेशन टूल की एक श्रृंखला विकसित की गई है, जो माइक्रोबियल समुदायों की संरचना प्राप्त करने के लिए प्रोटीन स्तर, पेप्टाइड स्तर और जीन स्तर पर प्रजातियों का एनोटेशन कर सकती है। अन्य ओमिक्स विधियों की तुलना में, माइक्रोबियल समुदायों का कार्यात्मक विश्लेषण मैक्रोप्रोटिओमिक्स की एक अनूठी विशेषता है। मैक्रोप्रोटिओमिक्स माइक्रोबियल समुदायों के मल्टी-ओमिक्स विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बन गया है, और अभी भी कवरेज गहराई, पहचान संवेदनशीलता और डेटा विश्लेषण पूर्णता के मामले में बड़ी विकास क्षमता है।

01नमूना पूर्व उपचार

वर्तमान में, मानव माइक्रोबायोम, मिट्टी, भोजन, महासागर, सक्रिय कीचड़ और अन्य क्षेत्रों के अनुसंधान में मेटाप्रोटोमिक्स तकनीक का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। किसी एकल प्रजाति के प्रोटिओम विश्लेषण की तुलना में, जटिल नमूनों के मेटाप्रोटिओम के नमूना पूर्व-उपचार को अधिक चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। वास्तविक नमूनों में माइक्रोबियल संरचना जटिल है, बहुतायत की गतिशील सीमा बड़ी है, विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों की कोशिका दीवार संरचना बहुत अलग है, और नमूनों में अक्सर बड़ी मात्रा में मेजबान प्रोटीन और अन्य अशुद्धियाँ होती हैं। इसलिए, मेटाप्रोटिओम के विश्लेषण में, विभिन्न प्रकार के नमूनों को अनुकूलित करना और विभिन्न माइक्रोबियल पृथक्करण, संवर्धन, निष्कर्षण और लसीका योजनाओं को अपनाना अक्सर आवश्यक होता है।

विभिन्न नमूनों से माइक्रोबियल मेटाप्रोटिओम के निष्कर्षण में कुछ समानताएं होने के साथ-साथ कुछ अंतर भी हैं, लेकिन वर्तमान में विभिन्न प्रकार के मेटाप्रोटिओम नमूनों के लिए एकीकृत पूर्व-प्रसंस्करण प्रक्रिया का अभाव है।

02मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण

शॉटगन प्रोटिओम विश्लेषण में, प्रीट्रीटमेंट के बाद पेप्टाइड मिश्रण को पहले क्रोमैटोग्राफिक कॉलम में अलग किया जाता है, और फिर आयनीकरण के बाद डेटा अधिग्रहण के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश किया जाता है। एकल प्रजाति प्रोटिओम विश्लेषण के समान, मैक्रोप्रोटिओम विश्लेषण में मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण मोड में डीडीए मोड और डीआईए मोड शामिल हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों के निरंतर पुनरावृत्ति और अद्यतन के साथ, उच्च संवेदनशीलता और रिज़ॉल्यूशन वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों को मेटाप्रोटोम पर लागू किया जाता है, और मेटाप्रोटोम विश्लेषण की कवरेज गहराई में भी लगातार सुधार होता है। लंबे समय से, ऑर्बिट्रैप के नेतृत्व में उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों की एक श्रृंखला का व्यापक रूप से मेटाप्रोटिओम में उपयोग किया गया है।

मूल पाठ की तालिका 1 नमूना प्रकार, विश्लेषण रणनीति, मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण, अधिग्रहण विधि, विश्लेषण सॉफ्टवेयर और पहचान की संख्या के संदर्भ में 2011 से वर्तमान तक मेटाप्रोटोमिक्स पर कुछ प्रतिनिधि अध्ययन दिखाती है।

03मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा विश्लेषण

3.1 डीडीए डेटा विश्लेषण रणनीति

3.1.1 डेटाबेस खोज

3.1.2नये सिरे सेअनुक्रमण रणनीति

3.2 डीआईए डेटा विश्लेषण रणनीति

04प्रजाति वर्गीकरण और कार्यात्मक एनोटेशन

विभिन्न वर्गीकरण स्तरों पर माइक्रोबियल समुदायों की संरचना माइक्रोबायोम अनुसंधान में प्रमुख अनुसंधान क्षेत्रों में से एक है। हाल के वर्षों में, माइक्रोबियल समुदायों की संरचना प्राप्त करने के लिए प्रोटीन स्तर, पेप्टाइड स्तर और जीन स्तर पर प्रजातियों को एनोटेट करने के लिए एनोटेशन टूल की एक श्रृंखला विकसित की गई है।

कार्यात्मक एनोटेशन का सार लक्ष्य प्रोटीन अनुक्रम की कार्यात्मक प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस से तुलना करना है। जीओ, सीओजी, केईजीजी, एगएनओजी इत्यादि जैसे जीन फ़ंक्शन डेटाबेस का उपयोग करके, मैक्रोप्रोटीम द्वारा पहचाने गए प्रोटीन पर विभिन्न कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषण किए जा सकते हैं। एनोटेशन टूल में Blast2GO, DAVID, KOBAS आदि शामिल हैं।

05सारांश और आउटलुक

सूक्ष्मजीव मानव स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल के वर्षों में, माइक्रोबियल समुदायों के कार्य का अध्ययन करने के लिए मेटाप्रोटोमिक्स एक महत्वपूर्ण तकनीकी साधन बन गया है। मेटाप्रोटिओमिक्स की विश्लेषणात्मक प्रक्रिया एकल-प्रजाति प्रोटिओमिक्स के समान है, लेकिन मेटाप्रोटिओमिक्स के अनुसंधान वस्तु की जटिलता के कारण, नमूना पूर्व-उपचार, डेटा अधिग्रहण से लेकर डेटा विश्लेषण तक प्रत्येक विश्लेषण चरण में विशिष्ट अनुसंधान रणनीतियों को अपनाने की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, प्रीट्रीटमेंट विधियों में सुधार, मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक के निरंतर नवाचार और जैव सूचना विज्ञान के तेजी से विकास के लिए धन्यवाद, मेटाप्रोटोमिक्स ने पहचान की गहराई और अनुप्रयोग दायरे में काफी प्रगति की है।

मैक्रोप्रोटिओम नमूनों के पूर्व-उपचार की प्रक्रिया में, नमूने की प्रकृति पर पहले विचार किया जाना चाहिए। पर्यावरणीय कोशिकाओं और प्रोटीन से सूक्ष्मजीवों को कैसे अलग किया जाए, यह मैक्रोप्रोटिओम के सामने आने वाली प्रमुख चुनौतियों में से एक है, और पृथक्करण दक्षता और माइक्रोबियल हानि के बीच संतुलन एक जरूरी समस्या है जिसे हल किया जाना चाहिए। दूसरे, सूक्ष्मजीवों के प्रोटीन निष्कर्षण में विभिन्न जीवाणुओं की संरचनात्मक विविधता के कारण होने वाले अंतर को ध्यान में रखना चाहिए। ट्रेस रेंज में मैक्रोप्रोटिओम नमूनों को भी विशिष्ट पूर्व-उपचार विधियों की आवश्यकता होती है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों के संदर्भ में, मुख्यधारा के मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण एलटीक्यू-ऑर्बिट्रैप और क्यू एक्सएक्टिव जैसे ऑर्बिट्रैप मास एनालाइज़र पर आधारित मास स्पेक्ट्रोमीटर से आयन गतिशीलता युग्मित टाइम-ऑफ़-फ़्लाइट मास एनालाइज़र जैसे टिम्सटीओएफ प्रो पर आधारित मास स्पेक्ट्रोमीटर में परिवर्तित हो गए हैं। . आयन गतिशीलता आयाम जानकारी वाले उपकरणों की timsTOF श्रृंखला में उच्च पहचान सटीकता, कम पहचान सीमा और अच्छी दोहराव क्षमता है। वे धीरे-धीरे विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं जिनके लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का पता लगाने की आवश्यकता होती है, जैसे कि एक ही प्रजाति के प्रोटिओम, मेटाप्रोटोम और मेटाबोलोम। यह ध्यान देने योग्य है कि लंबे समय से, मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों की गतिशील रेंज ने मेटाप्रोटिओम अनुसंधान की प्रोटीन कवरेज गहराई को सीमित कर दिया है। भविष्य में, बड़ी गतिशील रेंज वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण मेटाप्रोटिओम्स में प्रोटीन पहचान की संवेदनशीलता और सटीकता में सुधार कर सकते हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण के लिए, हालांकि डीआईए डेटा अधिग्रहण मोड को एक ही प्रजाति के प्रोटिओम में व्यापक रूप से अपनाया गया है, अधिकांश वर्तमान मैक्रोप्रोटिओम विश्लेषण अभी भी डीडीए डेटा अधिग्रहण मोड का उपयोग करते हैं। डीआईए डेटा अधिग्रहण मोड नमूने की खंड आयन जानकारी पूरी तरह से प्राप्त कर सकता है, और डीडीए डेटा अधिग्रहण मोड की तुलना में, इसमें मैक्रोप्रोटीम नमूने की पेप्टाइड जानकारी पूरी तरह से प्राप्त करने की क्षमता है। हालाँकि, DIA डेटा की उच्च जटिलता के कारण, DIA मैक्रोप्रोटिओम डेटा के विश्लेषण में अभी भी बड़ी कठिनाइयों का सामना करना पड़ रहा है। कृत्रिम बुद्धिमत्ता और गहन शिक्षण के विकास से डीआईए डेटा विश्लेषण की सटीकता और पूर्णता में सुधार होने की उम्मीद है।

मेटाप्रोटिओमिक्स के डेटा विश्लेषण में, प्रमुख चरणों में से एक प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस का निर्माण है। आंतों के वनस्पतियों जैसे लोकप्रिय अनुसंधान क्षेत्रों के लिए, आईजीसी और एचएमपी जैसे आंतों के माइक्रोबियल डेटाबेस का उपयोग किया जा सकता है, और अच्छे पहचान परिणाम प्राप्त किए गए हैं। अधिकांश अन्य मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषणों के लिए, सबसे प्रभावी डेटाबेस निर्माण रणनीति अभी भी मेटागेनोमिक अनुक्रमण डेटा के आधार पर एक नमूना-विशिष्ट प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस स्थापित करना है। उच्च जटिलता और बड़ी गतिशील रेंज वाले माइक्रोबियल समुदाय के नमूनों के लिए, कम बहुतायत वाली प्रजातियों की पहचान बढ़ाने के लिए अनुक्रमण गहराई को बढ़ाना आवश्यक है, जिससे प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस के कवरेज में सुधार होगा। जब अनुक्रमण डेटा की कमी होती है, तो सार्वजनिक डेटाबेस को अनुकूलित करने के लिए पुनरावृत्त खोज विधि का उपयोग किया जा सकता है। हालाँकि, पुनरावृत्तीय खोज एफडीआर गुणवत्ता नियंत्रण को प्रभावित कर सकती है, इसलिए खोज परिणामों को सावधानीपूर्वक जांचने की आवश्यकता है। इसके अलावा, मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषण में पारंपरिक एफडीआर गुणवत्ता नियंत्रण मॉडल की प्रयोज्यता अभी भी तलाशने लायक है। खोज रणनीति के संदर्भ में, हाइब्रिड स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी रणनीति डीआईए मेटाप्रोटोमिक्स की कवरेज गहराई में सुधार कर सकती है। हाल के वर्षों में, गहन शिक्षण के आधार पर तैयार की गई अनुमानित वर्णक्रमीय लाइब्रेरी ने डीआईए प्रोटिओमिक्स में बेहतर प्रदर्शन दिखाया है। हालाँकि, मेटाप्रोटिओम डेटाबेस में अक्सर लाखों प्रोटीन प्रविष्टियाँ होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर अनुमानित वर्णक्रमीय पुस्तकालय होते हैं, बहुत सारे कंप्यूटिंग संसाधनों की खपत होती है, और बड़े खोज स्थान में परिणाम होता है। इसके अलावा, मेटाप्रोटिओम में प्रोटीन अनुक्रमों के बीच समानता बहुत भिन्न होती है, जिससे वर्णक्रमीय पुस्तकालय भविष्यवाणी मॉडल की सटीकता सुनिश्चित करना मुश्किल हो जाता है, इसलिए पूर्वानुमानित वर्णक्रमीय पुस्तकालयों का व्यापक रूप से मेटाप्रोटोमिक्स में उपयोग नहीं किया गया है। इसके अलावा, अत्यधिक अनुक्रम-समान प्रोटीन के मेटाप्रोटोमिक्स विश्लेषण पर लागू करने के लिए नई प्रोटीन अनुमान और वर्गीकरण एनोटेशन रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है।

संक्षेप में, एक उभरती हुई माइक्रोबायोम अनुसंधान प्रौद्योगिकी के रूप में, मेटाप्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकी ने महत्वपूर्ण अनुसंधान परिणाम प्राप्त किए हैं और इसमें विकास की बड़ी संभावनाएं भी हैं।