यह आलेख आपको सिखाता है कि तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम कैसे चुनें

कच्चे माल, मध्यवर्ती, तैयारी और पैकेजिंग सामग्री में प्रत्येक घटक और अशुद्धियों की सामग्री का परीक्षण करने के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी मुख्य विधि है, लेकिन कई पदार्थों में भरोसा करने के लिए मानक विधियां नहीं होती हैं, इसलिए नई विधियों को विकसित करना अपरिहार्य है। तरल चरण विधियों के विकास में, क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम तरल क्रोमैटोग्राफी का मूल है, इसलिए उपयुक्त क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम कैसे चुनें यह महत्वपूर्ण है। इस लेख में, लेखक समझाएगा कि तीन पहलुओं से तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम कैसे चुनें: समग्र विचार, विचार और आवेदन का दायरा।

A.तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम चुनने के लिए समग्र विचार

1. विश्लेषक के भौतिक और रासायनिक गुणों का मूल्यांकन करें: जैसे कि रासायनिक संरचना, घुलनशीलता, स्थिरता (जैसे कि क्या इसे ऑक्सीकरण / कम / हाइड्रोलाइज्ड करना आसान है), अम्लता और क्षारीयता, आदि, विशेष रूप से रासायनिक संरचना महत्वपूर्ण है गुणों को निर्धारित करने में कारक, जैसे कि संयुग्मित समूह में मजबूत पराबैंगनी अवशोषण और मजबूत प्रतिदीप्ति होती है;

2. विश्लेषण का उद्देश्य निर्धारित करें: क्या उच्च पृथक्करण, उच्च स्तंभ दक्षता, कम विश्लेषण समय, उच्च संवेदनशीलता, उच्च दबाव प्रतिरोध, लंबे स्तंभ जीवन, कम लागत, आदि की आवश्यकता है;

1. एक उपयुक्त क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम चुनें: क्रोमैटोग्राफ़िक भराव की संरचना, भौतिक और रासायनिक गुणों को समझें, जैसे कि कण आकार, छिद्र आकार, तापमान सहनशीलता, पीएच सहनशीलता, विश्लेषक का सोखना, आदि।

1. तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम चुनने के लिए विचार

यह अध्याय क्रोमैटोग्राफी कॉलम के भौतिक और रासायनिक गुणों के परिप्रेक्ष्य से क्रोमैटोग्राफी कॉलम का चयन करते समय विचार किए जाने वाले कारकों पर चर्चा करेगा। 2.1 फिलर मैट्रिक्स

2.1.1 सिलिका जेल मैट्रिक्स अधिकांश तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम का फिलर मैट्रिक्स सिलिका जेल है। इस प्रकार के भराव में उच्च शुद्धता, कम लागत, उच्च यांत्रिक शक्ति होती है, और समूहों को संशोधित करना आसान होता है (जैसे कि फिनाइल बॉन्डिंग, एमिनो बॉन्डिंग, साइनो बॉन्डिंग इत्यादि), लेकिन पीएच मान और तापमान सीमा जो इसे सहन करती है वह सीमित है: अधिकांश सिलिका जेल मैट्रिक्स फिलर्स की पीएच रेंज 2 से 8 है, लेकिन विशेष रूप से संशोधित सिलिका जेल बॉन्डेड चरणों की पीएच रेंज 1.5 से 10 तक हो सकती है, और विशेष रूप से संशोधित सिलिका जेल बॉन्डेड चरण भी हैं जो कम पीएच पर स्थिर होते हैं, जैसे कि एगिलेंट ज़ोरबैक्स आरआरएचडी स्टेबलबॉन्ड-सी18, जो पीएच 1 से 8 पर स्थिर है; सिलिका जेल मैट्रिक्स की ऊपरी तापमान सीमा आमतौर पर 60 ℃ है, और कुछ क्रोमैटोग्राफी कॉलम उच्च पीएच पर 40 ℃ का तापमान सहन कर सकते हैं।

2.1.2 पॉलिमर मैट्रिक्स पॉलिमर फिलर्स ज्यादातर पॉलीस्टाइरीन-डिवाइनिलबेन्जीन या पॉलीमेथैक्रिलेट होते हैं। उनके फायदे यह हैं कि वे एक विस्तृत पीएच रेंज को सहन कर सकते हैं - उनका उपयोग 1 से 14 की रेंज में किया जा सकता है, और वे उच्च तापमान (80 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तक पहुंच सकते हैं) के प्रति अधिक प्रतिरोधी हैं। सिलिका-आधारित C18 फिलर्स की तुलना में, इस प्रकार के फिलर में मजबूत हाइड्रोफोबिसिटी होती है, और मैक्रोपोरस पॉलिमर प्रोटीन जैसे नमूनों को अलग करने में बहुत प्रभावी होता है। इसका नुकसान यह है कि कॉलम की दक्षता कम है और यांत्रिक शक्ति सिलिका-आधारित फिलर्स की तुलना में कमजोर है। 2.2 कण आकार

अधिकांश आधुनिक एचपीएलसी भराव गोलाकार कण होते हैं, लेकिन कभी-कभी वे अनियमित कण होते हैं। गोलाकार कण निम्न स्तंभ दबाव, उच्च स्तंभ दक्षता, स्थिरता और लंबा जीवन प्रदान कर सकते हैं; उच्च-चिपचिपाहट वाले मोबाइल चरणों (जैसे फॉस्फोरिक एसिड) का उपयोग करते समय या जब नमूना समाधान चिपचिपा होता है, तो अनियमित कणों का एक बड़ा विशिष्ट सतह क्षेत्र होता है, जो दो चरणों की पूर्ण कार्रवाई के लिए अधिक अनुकूल होता है, और कीमत अपेक्षाकृत कम होती है। 2.3 कण आकार

कण का आकार जितना छोटा होगा, स्तंभ की दक्षता उतनी ही अधिक होगी और पृथक्करण उतना ही अधिक होगा, लेकिन उच्च दबाव प्रतिरोध उतना ही खराब होगा। सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला कॉलम 5 माइक्रोन कण आकार वाला कॉलम है; यदि पृथक्करण की आवश्यकता अधिक है, तो 1.5-3 माइक्रोन भराव का चयन किया जा सकता है, जो कुछ जटिल मैट्रिक्स और बहु-घटक नमूनों की पृथक्करण समस्या को हल करने के लिए अनुकूल है। यूपीएलसी 1.5 μm फिलर्स का उपयोग कर सकता है; 10 माइक्रोन या बड़े कण आकार के फिलर्स का उपयोग अक्सर अर्ध-प्रारंभिक या प्रारंभिक स्तंभों के लिए किया जाता है। 2.4 कार्बन सामग्री

कार्बन सामग्री सिलिका जेल की सतह पर बंधित चरण के अनुपात को संदर्भित करती है, जो विशिष्ट सतह क्षेत्र और बंधी हुई चरण कवरेज से संबंधित है। उच्च कार्बन सामग्री उच्च स्तंभ क्षमता और उच्च रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है, और अक्सर उच्च पृथक्करण की आवश्यकता वाले जटिल नमूनों के लिए उपयोग की जाती है, लेकिन दो चरणों के बीच लंबी बातचीत के समय के कारण, विश्लेषण का समय लंबा होता है; कम कार्बन सामग्री वाले क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम में विश्लेषण का समय कम होता है और वे अलग-अलग चयनात्मकता दिखा सकते हैं, और अक्सर सरल नमूनों के लिए उपयोग किया जाता है जिनके लिए तेजी से विश्लेषण की आवश्यकता होती है और जिन नमूनों के लिए उच्च जलीय चरण स्थितियों की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, C18 की कार्बन सामग्री 7% से 19% तक होती है। 2.5 छिद्र आकार और विशिष्ट सतह क्षेत्र

एचपीएलसी सोखना मीडिया छिद्रपूर्ण कण हैं, और अधिकांश इंटरैक्शन छिद्रों में होते हैं। इसलिए, अणुओं को सोखने और अलग होने के लिए छिद्रों में प्रवेश करना चाहिए।

छिद्र का आकार और विशिष्ट सतह क्षेत्र दो पूरक अवधारणाएँ हैं। छोटे छिद्र आकार का अर्थ है बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र, और इसके विपरीत। एक बड़ा विशिष्ट सतह क्षेत्र नमूना अणुओं और बंधे हुए चरणों के बीच परस्पर क्रिया को बढ़ा सकता है, अवधारण को बढ़ा सकता है, नमूना लोडिंग और स्तंभ क्षमता को बढ़ा सकता है, और जटिल घटकों को अलग कर सकता है। पूरी तरह से छिद्रपूर्ण भराव इस प्रकार के भराव से संबंधित हैं। उच्च पृथक्करण आवश्यकताओं वाले लोगों के लिए, बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र वाले फिलर्स को चुनने की सिफारिश की जाती है; छोटा विशिष्ट सतह क्षेत्र पीठ के दबाव को कम कर सकता है, स्तंभ दक्षता में सुधार कर सकता है और संतुलन समय को कम कर सकता है, जो ढाल विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। कोर-शेल फिलर्स इस प्रकार के फिलर्स से संबंधित हैं। पृथक्करण सुनिश्चित करने के आधार पर, उच्च विश्लेषण दक्षता आवश्यकताओं वाले लोगों के लिए छोटे विशिष्ट सतह क्षेत्र वाले फिलर्स को चुनने की सिफारिश की जाती है। 2.6 छिद्र मात्रा और यांत्रिक शक्ति

छिद्र आयतन, जिसे "छिद्र आयतन" भी कहा जाता है, प्रति इकाई कण के रिक्त आयतन के आकार को संदर्भित करता है। यह भराव की यांत्रिक शक्ति को अच्छी तरह से प्रतिबिंबित कर सकता है। बड़े छिद्र वाले फिलर्स की यांत्रिक शक्ति छोटे छिद्र वाले फिलर्स की तुलना में थोड़ी कमजोर होती है। 1.5 एमएल/जी से कम या उसके बराबर छिद्र मात्रा वाले फिलर्स का उपयोग ज्यादातर एचपीएलसी पृथक्करण के लिए किया जाता है, जबकि 1.5 एमएल/जी से अधिक छिद्र मात्रा वाले फिलर्स का उपयोग मुख्य रूप से आणविक बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी और कम दबाव क्रोमैटोग्राफी के लिए किया जाता है। 2.7 कैपिंग दर

कैपिंग से यौगिकों और उजागर सिलानोल समूहों (जैसे क्षारीय यौगिकों और सिलानोल समूहों के बीच आयनिक बंधन, वैन डेर वाल्स बल और अम्लीय यौगिकों और सिलानोल समूहों के बीच हाइड्रोजन बांड) के बीच बातचीत के कारण होने वाली पूंछ की चोटियों को कम किया जा सकता है, जिससे स्तंभ दक्षता और शिखर आकार में सुधार होता है। . अनकैप्ड बॉन्डेड चरण, विशेष रूप से ध्रुवीय नमूनों के लिए, कैप्ड बॉन्डेड चरणों के सापेक्ष विभिन्न चयनात्मकताएं उत्पन्न करेंगे।

1. विभिन्न तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभों का अनुप्रयोग दायरा

यह अध्याय कुछ मामलों के माध्यम से विभिन्न प्रकार के तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम के अनुप्रयोग दायरे का वर्णन करेगा।

3.1 उलट-चरण C18 क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम

C18 कॉलम सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला उलट-चरण कॉलम है, जो अधिकांश कार्बनिक पदार्थों की सामग्री और अशुद्धता परीक्षणों को पूरा कर सकता है, और मध्यम-ध्रुवीय, कमजोर ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय पदार्थों पर लागू होता है। C18 क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम के प्रकार और विनिर्देश को विशिष्ट पृथक्करण आवश्यकताओं के अनुसार चुना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, उच्च पृथक्करण आवश्यकताओं वाले पदार्थों के लिए, 5 μm*4.6 मिमी*250 मिमी विनिर्देशों का अक्सर उपयोग किया जाता है; जटिल पृथक्करण मैट्रिक्स और समान ध्रुवता वाले पदार्थों के लिए, 4 माइक्रोन*4.6 मिमी*250 मिमी विनिर्देशों या छोटे कण आकार का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लेखक ने सेलेकॉक्सिब एपीआई में दो जीनोटॉक्सिक अशुद्धियों का पता लगाने के लिए 3 μm*4.6 मिमी*250 मिमी कॉलम का उपयोग किया। दो पदार्थों का पृथक्करण 2.9 तक पहुंच सकता है, जो उत्कृष्ट है। इसके अलावा, पृथक्करण सुनिश्चित करने के आधार पर, यदि तीव्र विश्लेषण की आवश्यकता होती है, तो अक्सर 10 मिमी या 15 मिमी का एक छोटा स्तंभ चुना जाता है। उदाहरण के लिए, जब लेखक ने पाइपरक्विन फॉस्फेट एपीआई में जीनोटॉक्सिक अशुद्धता का पता लगाने के लिए एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग किया, तो 3 माइक्रोन * 2.1 मिमी * 100 मिमी कॉलम का उपयोग किया गया था। अशुद्धता और मुख्य घटक के बीच पृथक्करण 2.0 था, और एक नमूने का पता लगाना 5 मिनट में पूरा किया जा सकता है। 3.2 उलट-चरण फिनाइल कॉलम

फिनाइल स्तंभ भी एक प्रकार का उलटा-चरण स्तंभ है। इस प्रकार के स्तंभ में सुगंधित यौगिकों के लिए मजबूत चयनात्मकता होती है। यदि साधारण C18 कॉलम द्वारा मापे गए सुगंधित यौगिकों की प्रतिक्रिया कमजोर है, तो आप फिनाइल कॉलम को बदलने पर विचार कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, जब मैं सेलेकॉक्सिब एपीआई बना रहा था, तो उसी निर्माता के फिनाइल कॉलम और समान विनिर्देश (सभी 5 μm * 4.6 मिमी * 250 मिमी) द्वारा मापी गई मुख्य घटक प्रतिक्रिया C18 कॉलम की तुलना में लगभग 7 गुना थी। 3.3 सामान्य-चरण स्तंभ

उलट-चरण स्तंभ के प्रभावी पूरक के रूप में, सामान्य-चरण स्तंभ अत्यधिक ध्रुवीय यौगिकों के लिए उपयुक्त है। यदि उलट-चरण कॉलम में 90% से अधिक जलीय चरण के साथ उत्सर्जक होने पर शिखर अभी भी बहुत तेज़ है, और यहां तक ​​कि विलायक शिखर के करीब और ओवरलैप होता है, तो आप सामान्य-चरण कॉलम को बदलने पर विचार कर सकते हैं। इस प्रकार के कॉलम में हिलिक कॉलम, अमीनो कॉलम, सायनो कॉलम आदि शामिल हैं।

3.3.1 हिलिक कॉलम हिलिक कॉलम आमतौर पर ध्रुवीय पदार्थों की प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए बंधी हुई एल्काइल श्रृंखला में हाइड्रोफिलिक समूहों को एम्बेड करता है। इस प्रकार का कॉलम शर्करा पदार्थों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। लेखक ने ज़ाइलोज़ और उसके डेरिवेटिव की सामग्री और संबंधित पदार्थों पर चर्चा करते समय इस प्रकार के कॉलम का उपयोग किया। ज़ाइलोज़ व्युत्पन्न के आइसोमर्स को भी अच्छी तरह से अलग किया जा सकता है;

3.3.2 एमिनो कॉलम और साइनो कॉलम एमिनो कॉलम और साइनो कॉलम विशेष पदार्थों के लिए चयनात्मकता में सुधार करने के लिए क्रमशः बंधी हुई एल्काइल श्रृंखला के अंत में एमिनो और साइनो संशोधनों की शुरूआत को संदर्भित करते हैं: उदाहरण के लिए, एमिनो कॉलम एक अच्छा विकल्प है शर्करा, अमीनो एसिड, क्षार और एमाइड को अलग करने के लिए; संयुग्मित बंधों की उपस्थिति के कारण हाइड्रोजनीकृत और गैर-हाइड्रोजनीकृत संरचनात्मक समान पदार्थों को अलग करते समय साइनो कॉलम में बेहतर चयनात्मकता होती है। अमीनो कॉलम और सायनो कॉलम को अक्सर सामान्य चरण कॉलम और रिवर्स चरण कॉलम के बीच स्विच किया जा सकता है, लेकिन बार-बार स्विच करने की अनुशंसा नहीं की जाती है। 3.4 चिरल स्तंभ

जैसा कि नाम से पता चलता है, चिरल कॉलम, विशेष रूप से फार्मास्यूटिकल्स के क्षेत्र में, चिरल यौगिकों के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार के कॉलम पर तब विचार किया जा सकता है जब पारंपरिक रिवर्स चरण और सामान्य चरण कॉलम आइसोमर्स के पृथक्करण को प्राप्त नहीं कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, लेखक ने 1,2-डिफेनिलएथिलीनडायमाइन के दो आइसोमर्स को अलग करने के लिए 5 μm*4.6 मिमी*250 मिमी चिरल कॉलम का उपयोग किया: (1S, 2S)-1, 2-डिफेनिलएथिलीनडायमाइन और (1R, 2R)-1, 2 -डिफेनिलएथिलीनडायमाइन, और दोनों के बीच अलगाव लगभग 2.0 तक पहुंच गया। हालाँकि, चिरल कॉलम अन्य प्रकार के कॉलमों की तुलना में अधिक महंगे होते हैं, आमतौर पर 1W+/टुकड़ा। यदि ऐसे स्तंभों की आवश्यकता है, तो इकाई को पर्याप्त बजट बनाने की आवश्यकता है। 3.5 आयन एक्सचेंज कॉलम

आयन एक्सचेंज कॉलम आवेशित आयनों, जैसे आयन, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और कुछ चीनी पदार्थों को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त हैं। भराव प्रकार के अनुसार, उन्हें कटियन एक्सचेंज कॉलम, आयन एक्सचेंज कॉलम और मजबूत कटियन एक्सचेंज कॉलम में विभाजित किया गया है।

धनायन विनिमय स्तंभों में कैल्शियम-आधारित और हाइड्रोजन-आधारित स्तंभ शामिल हैं, जो मुख्य रूप से अमीनो एसिड जैसे धनायनित पदार्थों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। उदाहरण के लिए, लेखक ने फ्लशिंग समाधान में कैल्शियम ग्लूकोनेट और कैल्शियम एसीटेट का विश्लेषण करते समय कैल्शियम-आधारित कॉलम का उपयोग किया। दोनों पदार्थों की λ=210nm पर मजबूत प्रतिक्रिया थी, और पृथक्करण की डिग्री 3.0 तक पहुंच गई; ग्लूकोज से संबंधित पदार्थों का विश्लेषण करते समय लेखक ने हाइड्रोजन-आधारित स्तंभों का उपयोग किया। कई प्रमुख संबंधित पदार्थ - माल्टोज़, माल्टोट्रायोज़ और फ्रुक्टोज़ - में अंतर डिटेक्टरों के तहत उच्च संवेदनशीलता थी, जिसकी पहचान सीमा 0.5 पीपीएम और पृथक्करण डिग्री 2.0-2.5 थी।

आयन एक्सचेंज कॉलम मुख्य रूप से कार्बनिक अम्ल और हैलोजन आयन जैसे आयनिक पदार्थों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं; मजबूत धनायन विनिमय स्तंभों में उच्च आयन विनिमय क्षमता और चयनात्मकता होती है, और जटिल नमूनों के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए उपयुक्त होते हैं।

उपरोक्त लेखक के स्वयं के अनुभव के साथ संयुक्त रूप से कई सामान्य तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभों के प्रकार और अनुप्रयोग श्रेणियों का परिचय मात्र है। वास्तविक अनुप्रयोगों में अन्य विशेष प्रकार के क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम हैं, जैसे बड़े-छिद्र क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम, छोटे-छिद्र क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम, एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफ़ी कॉलम, मल्टीमोड क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम, अल्ट्रा-उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफ़ी कॉलम (यूएचपीएलसी), सुपरक्रिटिकल तरल क्रोमैटोग्राफ़ी कॉलम ( एसएफसी), आदि वे विभिन्न क्षेत्रों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। विशिष्ट प्रकार के क्रोमैटोग्राफ़िक कॉलम का चयन नमूने की संरचना और गुणों, पृथक्करण आवश्यकताओं और अन्य उद्देश्यों के अनुसार किया जाना चाहिए।